Thèse Etude d'Un Petit Arn Non-Codant Impliqué dans la Répression de la Transformation Naturelle chez la Bactérie Pathogène Legionella Pneumophila. H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Claude Bernard Lyon 1 École doctorale : E2M2 - Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation Laboratoire de recherche : CIRI - CENTRE INTERNATIONAL DE RECHERCHE EN INFECTIOLOGIE Direction de la thèse : Laetitia ATTAIECH ORCID 0000000261881839 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-09T23:59:59 Les ARN non codants (ARNnc) jouent un rôle essentiel dans la physiologie cellulaire, participant à de nombreux processus, notamment la régulation de l'expression génique. Cette régulation implique l'appariement des bases de l'ARNnc avec des ARN messagers (ARNm) cibles, souvent avec l'aide de chaperons protéiques, mais comprendre les détails moléculaires et la dynamique de la répression reste un défi majeur. Chez les bactéries, la protéine Hfq a longtemps été considérée comme la seule chaperonne à ARNnc multi-cible. Cependant, nous avons récemment identifié et caractérisé la protéine RocC de Legionella pneumophila, un pathogène bactérien, comme étant la chaperonne à ARN de l'ARNnc multi-cible RocR. Nous avons montré que RocC fait partie d'une famille de protéines possédant un domaine conservé ProQ/FinO très répandues chez les bactéries, et que ce domaine permet leur interaction avec des ARN. Deux membres de cette famille contrôlent deux mécanismes distincts de transfert horizontal de gènes (HGT) : la conjugaison (FinO) et la transformation naturelle (RocC). Les HGT favorisent l'évolution du génome en réponse aux interventions thérapeutiques et prophylactiques. Comprendre les mécanismes de régulation des HGT pourrait donc, à terme, aider à prévenir l'acquisition et la propagation d'antibiorésistances.
Chez L. pneumophila, nous avons montré que RocC stabilise RocR, et ensemble, ils ciblent les ARNm des gènes codant pour des protéines impliquées dans la transformation naturelle et répriment ainsi ce phénomène. Grâce à une collaboration internationale, nous avons récemment obtenu une structure partielle du complexe RocC/R et des expériences préliminaires de RMN montrent que la structure complète est beaucoup plus complexe et implique un repliement original de RocR. Ce projet de thèse s'inscrit dans un projet collaboratif financé par l'ANR (PRCI RocCRcollab, Attaiech/Kreutz/Tollinger) ayant pour but de mieux définir les mécanismes moléculaires et la dynamique sous-jacents à l'interaction entre RocC et RocR et à la régulation de leurs ARNm cibles. Des approches biochimiques et de biologie cellulaire seront utilisées pour étudier le complexe RocC/RocR/ARNm cible, et plus largement identifier les bases moléculaires des interactions entre protéines chaperonnes et ARN, et du mécanisme de répression post-transcriptionnelle. Les transferts horizontaux de gènes (THG) jouent un rôle majeur dans l'évolution des espèces. Ces transferts sont particulièrement fréquents chez les bactéries et permettent l'acquisition de gènes et groupes de gènes conférant un avantage sélectif (Furuya and Lowy, 2006). La transformation naturelle est un mécanisme de THG très répandu qui permet aux bactéries d'acquérir et d'intégrer de l'ADN exogène libre (Johnston et al., 2014). Ce mode d'acquisition de gène n'implique pas de vecteur externe et est exclusivement sous contrôle de l'organisme bactérien. Une machinerie moléculaire complexe exprimée par les bactéries leur permet de capter l'ADN environnant, de l'importer activement dans le cytoplasme sous forme simple brin afin de l'intégrer dans le chromosome par recombinaison homologue. Le système d'import d'ADN est exprimé lorsque les bactéries entrent dans un état physiologique souvent transitoire appelé compétence. Les signaux et mécanismes qui induisent l'état de compétence et l'expression de la machinerie d'import d'ADN restent encore mal compris (Johnston et al., 2014).
Chez la bactérie pathogène Legionella pneumophila, nous avons découvert que la compétence est régulée par un système de répression post-transcriptionnel très original impliquant deux partenaires que nous avons baptisés RocC et RocR (Attaiech et al., 2016). Nous avons montré que RocC fait partie d'une famille de protéines possédant un domaine conservé ProQ/FinO très répandues chez les bactéries, et que ce domaine permet leur interaction avec des ARN.
Chez L. pneumophila, RocC est la chaperonne à ARN du petit ARN non-codant (ARNnc) multi-cible RocR qui cible les ARNm des gènes codant pour des protéines impliquées dans la transformation naturelle. L'interaction de ces ARNm avec le complexe RocC/RocR provoque le blocage de leur traduction et leur dégradation ce qui explique la répression de la compétence.
Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-tendant la fonction du système RocC/RocR, nous avons réalisé une caractérisation structurelle et fonctionnelle du complexe. Après de nombreuses tentatives infructueuses de cristallisation de la protéine RocC, nous avons décidé d'identifier le domaine minimal de liaison à l'ARN de RocC, ainsi que la région minimale de RocR nécessaire à la liaison avec RocC. À l'aide d'approches in vivo (mutagénèse et analyses phénotypiques) et in vitro (réalisées par notre collaborateur canadien), nous avons déterminé qu'une version tronquée de RocC (des acides aminés 14 à 126) et un fragment de RocR (3ième tige-boucle avec une tige plus courte et une tétraboucle) formaient facilement un complexe stable dont nous avons obtenu la structure par cristallographie (Kim et al., 2022). L'importance des interactions observées dans la structure a été confirmée par mutagénèse dirigée basée sur la structure, combinée à des analyses de liaison à l'ARN et à des mesures in vivo de la compétence. La structure permet également d'expliquer des résultats antérieurs obtenus par mutagénèse dirigée sur FinO et ProQ (Ghetu et al., 2002; Pandey et al., 2020), suggérant un mécanisme de liaison commun à l'ensemble de la famille des protéines contenant un domaine ProQ/FinO.
Cette détermination de la structure du complexe, bien que partielle, a constitué une avancée majeure, nous permettant de caractériser en détail les interactions entre le domaine de liaison à l'ARN de RocC (domaine ProQ/FinO) et le terminateur (3') de RocR. Cependant, nous avons précédemment établi que la fonction du système RocC/RocR comme répresseur de la compétence implique le domaine C-terminal de RocC, ainsi que la tige-boucle 5' de RocR, qui porte la séquence nécessaire au ciblage des ARNm de compétence (Attaiech et al., 2016). De plus, des expériences préliminaires de RMN réalisées par nos collaborateurs autrichien montrent que la structure complète est beaucoup plus complexe et pourrait faire intervenir un repliement original de RocR.
Ce projet s'inscrit dans une collaboration internationale ayant pour but d'étudier le complexe RocC/RocR/ARNm cible, et plus largement identifier les bases moléculaires des interactions entre protéines chaperonnes et ARN, et la mécanistique du processus de répression post-transcriptionnelle. Les méthodes de biophysique de pointe utilisées par nos collaborateurs seront combinées avec les approches biochimiques et de biologie cellulaire de notre laboratoire. En nous appuyant sur nos expertises complémentaires, nos résultats nous permettront de pleinement caractériser le système RocC/RocR. Nous analyserons la dynamique de l'interaction des molécules complètes de RocC et RocR, ainsi que leur interaction avec leurs ARNm cibles, afin d'élucider les détails moléculaires du mécanisme de répression post-transcriptionnel. En combinant nos approches de génétique, biologie cellulaire et biochimie avec les techniques de biologie structurale de pointe (RMN, SAXS, ITC) utilisées par nos collaborateurs autrichiens, nous voulons étudier les principes moléculaires d'un système de répression post-transcriptionnelle impliquant une protéine chaperonne à ARN et un petit ARN non-codant (ARNnc) multi-cible. Clonage et génétique bactérienne, Transformation chez Escherichia coli et Legionella pneumophila, Analyse de fluorescence, Etude d'expression génique, Western-blot et Northern-blot, RT-qPCR et -dPCR, Immunoprécipitation.

Master 2 de microbiologie, biologie cellulaire ou biochimie avec de fortes connaissances en génétique et régulation génique chez les bactéries. Une bonne expérience des techniques de bactériologie, biologie moléculaire et biochimie est requise.