Thèse Deepen Caractérisation et Correction de Variants d'Épissage Introniques Profonds dans les Maladies Génétiques Rares Associées aux Gènes Abca4 Pmm2 et Nbas H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Claude Bernard Lyon 1 École doctorale : NSCo - Neurosciences et Cognition Laboratoire de recherche : CRNL - CENTRE DE RECHERCHE EN NEUROSCIENCES DE LYON Direction de la thèse : Patrick EDERY ORCID 0000000189765832 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-05-31T23:59:59 Le projet DEEPEN (DEciphering Endogenous Pseudo-Exons for ENgineered therapeutics) vise à caractériser et corriger les anomalies d'épissage de l'ARN induites par des variants introniques profonds dans des maladies génétiques rares associées aux gènes ABCA4, PMM2 et NBAS (variants c.5196+1137G>A, c.640-15479C>T et c.4798-4884G>T respectivement). ABCA4 affecte la rétine (neurosensoriel), PMM2 conduit à un trouble du développement intellectuel sévère syndromique et le phénotype NBAS a une composante neurologique, en cohérence avec les thématiques de notre équipe de recherche en génétique du neurodéveloppement (GENDEV). Notre équipe GENDEV a développé de longue date des compétences sur les pathologies neurologiques et sur les mécanismes de l'épissage, ce qui nous place idéalement pour répondre aux enjeux scientifiques de ce projet ambitieux.
Les variants introniques profonds peuvent perturber l'épissage du pré-ARNm par différents mécanismes pathologiques, principalement par activation de pseudo-exons, c'est-à-dire par l'inclusion de séquences introniques aberrantes dans le transcrit mature. Ces anomalies conduisent à la production de protéines tronquées ou non fonctionnelles. Cependant, leurs conséquences fonctionnelles restent encore insuffisamment caractérisées, ce qui limite (i) leur interprétation en génétique médicale, (ii) la compréhension des mécanismes physiopathologiques et (iii) le développement de stratégies thérapeutiques ciblées.
Ce projet de thèse repose sur une approche intégrée et translationnelle. Dans une première phase, une analyse rétrospective de données cliniques et génétiques issues du soin sera réalisée afin d'identifier et de prioriser des variants introniques candidats à la mise en oeuvre d'une stratégie thérapeutique. Des outils bio-informatiques spécialisés (SpliceAI, MaxEntScan, CADD-Splice, MMSplice) seront utilisés pour prédire leurs effets sur l'épissage. Ces prédictions seront validées expérimentalement à l'aide d'approches de biologie moléculaire, incluant la RT-PCR, le RNA-seq et les systèmes de minigènes, à partir de matériel biologique dérivé des patients (sang, fibroblastes, lignées cellulaires pertinentes). Cette étape permettra de caractériser précisément les mécanismes d'épissage aberrants.
Dans une seconde phase, une approche innovante basée sur les oligonucléotides antisens (ASO) sera développée. Des ASO seront conçus de manière rationnelle afin de corriger les défauts d'épissage identifiés, puis testés in vitro dans des modèles cellulaires. Cette stratégie permettra d'apporter une preuve de concept de correction thérapeutique personnalisée ciblant l'ARN.
Dans une perspective translationnelle, ces approches seront également évaluées dans des modèles cellulaires physiologiquement pertinents dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) obtenues à partir de fibroblastes des patients. La différenciation en organoïdes spécifiques des tissus atteints, notamment des organoïdes rétiniens pour les variants du gène ABCA4 et hépatiques (collaboration) pour NBAS (les fibroblastes seront adaptés pour PMM2), permettra d'étudier l'efficacité des ASO dans un contexte proche du contexte physiopathologique. Cette approche, facilitée par la plateforme de l'INMG-PGNM (reprogrammation des fibroblastes en iPSCs, édition de contrôles), renforcera la pertinence translationnelle des résultats et facilitera leur transfert en clinique.
Ce projet a l'ambition de mettre en place un pipeline translationnel reposant sur une approche thérapeutique de type n-of-few dans le cas de trois mutations introniques profondes récurrentes identifiées chez plusieurs patients jeunes, accessibles à une approche de type ASO, ouvrant la voie à des traitements personnalisés pour des maladies rares évolutives sévères ne bénéficiant actuellement d'aucune thérapeutique efficace.
Les maladies génétiques rares associées aux gènes ABCA4, PMM2 et NBAS constituent des pathologies complexes, autosomiques récessives, caractérisées par une grande hétérogénéité clinique et une atteinte potentiellement multi systémique pour PMM2 et NBAS. Selon le gène impliqué, elles peuvent affecter la rétine (ABCA4), le cerveau ou d'autres organes (PMM2 et NBAS). Les dystrophies rétiniennes de Stargardt (ABCA4) et les troubles de la glycosylation conduisant à un trouble du développement intellectuel sévère syndromique (PMM2) sont bien décrits. Les atteintes neurologiques, hépatiques et immunitaires associées à NBAS sont moins bien connues (Allikmets et al., 1997 ; Cremers et al., 2020 ; Jaeken & Matthijs, 2007 ; Freeze et al., 2014 ; Haack et al., 2015 ; Staufner et al., 2016).
Au-delà des mutations affectant directement les régions codantes, un nombre croissant de variants introniques profonds a été identifié comme responsable d'altérations de l'épissage de l'ARN pré-messager. Ces variants peuvent perturber la reconnaissance des sites d'épissage, conduire à l'activation de sites cryptiques, à l'inclusion de pseudo-exons ou encore à des phénomènes d'exon skipping. Ces mécanismes aboutissent à la production de transcrits aberrants pouvant être instables ou non fonctionnels (Vaz-Drago et al., 2017). De manière plus générale, la régulation et les dysfonctionnements de l'épissage alternatif constituent un mécanisme central dans de nombreuses maladies humaines (Lee & Rio, 2015). Dans les trois cas étudiés, la mutation intronique profonde conduit à l'introduction d'un pseudo-exon, un mécanisme largement décrit dans la littérature comme une conséquence fréquente des variants introniques pathogènes (Sangermano et al., 2016 ; Anna & Monika, 2018 ; Vaz-Drago et al., 2017). Pour le variant intronique profond c.4798-4884G>T de NBAS, l'inclusion d'un pseudo-exon de 109 pb dans l'intron 40 a déjà été confirmée (AP-HP Bicêtre, données non publiées).
Plusieurs travaux ont mis en évidence que des variants pathogènes introniques profonds de ABCA4 sont directement responsables de défauts d'épissage, contribuant à la diversité phénotypique des dystrophies rétiniennes (Braun et al., 2013 ; Sangermano et al., 2016). De façon similaire, certaines mutations de PMM2 altèrent le processus d'épissage et conduisent à des troubles congénitaux de la glycosylation (Vega et al., 2009).
Au plan diagnostique, ces variants représentent un défi majeur, car ils sont fréquemment classés comme variants de signification incertaine. Leur interprétation nécessite donc des approches fonctionnelles permettant d'évaluer leur impact réel sur l'épissage et sur la production des transcrits. Cette caractérisation est essentielle pour améliorer la précision du diagnostic génétique et affiner les corrélations génotype-phénotype. Dans notre projet, la caractérisation précise et la quantification de tous les transcrits d'épissages résultant des mutations introniques profondes étudiées est une étape indispensable, même si ceux-ci sont déjà partiellement connus.
Le poids de la mutation intronique profonde dans le phénotype des patients que nous étudierons dépend de la seconde mutation. Il est donc spécifique à chaque patient. Dans les trois pathologies concernées par ce travail, les parents hétérozygotes des patients étudiés sont tous indemnes.
Les oligonucléotides antisens (ASO) représentent une approche thérapeutique émergente permettant de moduler l'épissage de manière ciblée en interagissant avec l'ARN pré-messager. Ils peuvent corriger des défauts d'épissage en masquant des sites cryptiques ou en modifiant la reconnaissance de séquences spécifiques. Les avancées récentes ont confirmé le potentiel clinique de ces approches dans plusieurs maladies génétiques rares, ouvrant la voie à des stratégies de médecine de précision de plus en plus personnalisées et spécifiques (Havens & Hastings, 2016 ; Hammond et al., 2021 ; Kim et al., 2023). L'exemple fondateur du milasen, ASO personnalisé développé en moins d'un an pour une patiente atteinte de céroïde-lipofuscinose neuronale (Kim et al., 2019, NEJM), a démontré la faisabilité d'une approche n-of-1 pour des variants introniques profonds activant des pseudo-exons.
L'intérêt de cette stratégie est particulièrement marqué pour les pathologies étudiées ici. En effet, les dystrophies rétiniennes causées par ABCA4 sont des maladies visuelles dégénératives, conduisant progressivement à la cécité, pour lesquelles il n'existe à ce jour aucun traitement curatif. La restauration, même partielle, d'un épissage correct pourrait suffire à ralentir significativement la progression de la maladie, voire à la stopper, chez les patients concernés. Dans le cas du variant intronique profond de PMM2, la correction du défaut d'épissage pourrait permettre de restaurer une activité enzymatique résiduelle, ce qui est souvent suffisant pour conduire à une glycosylation fonctionnelle. Enfin, pour les patients porteurs de la mutation intronique profonde de NBAS étudiée, la correction de l'épissage pourrait contribuer à prévenir les épisodes de défaillance hépatique aiguë et stopper l'évolution vers une hépatopathie terminale et pourrait prévenir la survenue des symptômes associés, en particulier neurologiques.
Ainsi, cibler les variants pathogènes introniques profonds par une approche par ASO présente un double intérêt : d'une part, agir directement sur le mécanisme moléculaire causal en amont de la production protéique, et d'autre part, offrir une stratégie thérapeutique adaptable et personnalisable en fonction du variant spécifique de chaque patient. Cette approche s'inscrit pleinement dans le cadre de la médecine de précision et apparaît particulièrement pertinente pour les variants introniques profonds, hors de portée des stratégies thérapeutiques conventionnelles.

1-Objectif général :
Caractériser les anomalies d'épissage liées aux variants introniques profonds dans les gènes ABCA4, PMM2 et NBAS et développer une preuve de concept de correction thérapeutique par oligonucléotides antisens (ASO).
2- Objectifs spécifiques
- Identifier les patients porteurs d'anomalies d'épissage accessibles à une thérapie par ASO à partir de données cliniques et génétiques obtenues dans notre Centre de Référence Maladies Rares (CRMR) CLAD Sud-Est (= centre de la filière AnDDI-Rares et du réseau européen ERN ITHACA)
- Valider expérimentalement et caractériser de façon précise les mécanismes d'épissage aberrants
- Identifier les marqueurs d'efficacité pertinents
- Développer des oligonucléotides antisens correcteurs in vitro
Le projet repose sur une approche intégrée :
- Analyse rétrospective de données cliniques et génétiques
- Séquençage génomique à partir du tissu sanguin chez les patients étudiés pour rechercher d'éventuels variants modificateurs du phénotype (évaluer les perspectives d'amélioration du phénotype ou de guérison par le traitement par ASO)
- Annotation bio-informatique des variants introniques (SpliceAI, MaxEntScan, CADD-Splice, MMSplice)
- Validation fonctionnelle par analyses transcriptomiques sur sang et fibroblastes des patients (RNA-seq, RT-PCR ciblée, Minigènes)
- Quantification des isoformes d'épissage par RT-qPCR, PCR digitale (dPCR) et amplicon-seq
- Identification de marqueurs d'efficacité de la correction par ASO
- Conception d'oligonucléotides antisens
- Transfection in vitro des cellules ou minigènes avec ASO ciblant le pseudo-exon.
- Quantification de la réduction de l'inclusion du pseudo-exon (critère 50%) et restauration de l'ARN normal.
- Conception rationnelle d'ASO de type steric blocking (chimie 2'-MOE / phosphorothioate) et test in vitro dans des modèles cellulaires (fibroblastes, HEK293T)

Chronogramme prévisionnel (36 mois)

Phase 1 - Analyse rétrospective et caractérisation moléculaire (M1-M12)

M1-M4 : Analyse rétrospective des données cliniques et génomiques (MR-004). Annotation bio-informatique des variants introniques profonds candidats (SpliceAI, CADD-Splice, MMSplice). Priorisation des variants pour les trois gènes cibles (ABCA4 c.5196+1137G>A, PMM2 c.640-15479C>T, NBAS c.4798-4884G>T).

M3-M8 : Obtention et culture des fibroblastes de patients. Extraction ARN, RT-PCR qualitative et quantitative (RT-qPCR, dPCR) pour quantification du ratio transcrits normaux/aberrants. RNA-seq ciblé.

M6-M12 : Construction des systèmes de minigènes pour chaque variant (collaboration LBMC/ReGArDS). Validation fonctionnelle de l'effet d'épissage en système rapporteur (HEK293T). Établissement des corrélations génotype-phénotype.

Livrable : Article 1 - Caractérisation fonctionnelle des variants introniques profonds (cible : EJHG ou Human Mutation).

Phase 2 - Design et criblage des ASO (M10-M24)

M10-M16 : Design rationnel des ASO candidats (chimie 2'-MOE / phosphorothioate) ciblant les sites d'épissage cryptiques activés par chaque variant. Collaboration avec le DCRT (Leiden) pour le design et la synthèse. Criblage initial par minigènes dans HEK293T.

M14-M20 : Test des ASO sélectionnés sur fibroblastes de patients. Quantification de la correction d'épissage (RT-qPCR, dPCR, amplicon-seq). Établissement des courbes dose-réponse et cinétiques.

M18-M24 : Validation croisée dans des modèles cellulaires tissu-spécifiques si disponibles (collaboration INMG-PGNM pour iPSC ; Heidelberg/Staufner pour protocoles NBAS). Identification des biomarqueurs d'efficacité.

Livrable : Article 2 - Preuve de concept ASO pour variants introniques profonds multi-gènes (cible : Molecular Therapy Nucleic Acids ou Nucleic Acids Research).

Phase 3 - Consolidation translationnelle et perspectives (M22-M36)

M22-M28 : Optimisation des meilleurs ASO candidats. Études de spécificité (off-target splicing par RNA-seq global). Analyse comparative de l'efficacité entre les trois gènes pour établir un pipeline généralisable.

M26-M32 : Constitution du dossier translationnel : compilation des données d'efficacité, de spécificité et de toxicité cellulaire. Préparation des éléments pour un dépôt de projet collaboratif (ANR, EJP-RD ou PHRC-N).

M30-M36 : Rédaction du manuscrit de thèse. Finalisation des publications. Communications en congrès (ESHG, SSIEM, RNA Society). Évaluation des perspectives de transfert clinique n-of-1 / n-of-few.

Livrable : Article 3 (optionnel) - Revue ou perspective sur les stratégies ASO pour variants introniques profonds en maladies rares. Manuscrit de thèse.

Le ou la candidat(e) devra être titulaire d'un Master 2 (ou équivalent), avec de bonnes bases en biologie cellulaire et moléculaire, notamment en techniques de type PCR et RT-PCR.

Une formation en génétique sera appréciée, ainsi qu'un intérêt pour l'épissage de l'ARN ou la transcriptomique.

Nous recherchons une personne rigoureuse, curieuse et capable de prendre du recul sur ses résultats. La capacité à analyser des données complexes et à travailler en collaboration dans un environnement multidisciplinaire sera essentielle. Une réelle motivation pour la recherche translationnelle et la médecine de précision est attendue, ainsi qu'un bon niveau d'anglais scientifique.