Thèse Décryptage des Mécanismes de Défense Anti-Phages Médiés par les Prophages chez Pseudomonas Aeruginosa H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Claude Bernard Lyon 1 École doctorale : E2M2 - Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation Laboratoire de recherche : MMSB - MICROBIOLOGIE MOLECULAIRE ET BIOCHIMIE STRUCTURALE Direction de la thèse : Anne CHEVALLEREAU ORCID 0000000333697468 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-09T23:59:59 Les bactéries résistantes aux antibiotiques posent un grave problème de santé publique. Une alternative prometteuse est l'utilisation de virus naturels, les phages, pour les combattre. Cependant, les bactéries développent aussi des résistances à ces phages, ce qui limite leur efficacité. Certains phages intégrés dans l'ADN bactérien, appelés prophages, peuvent eux-mêmes protéger la bactérie contre des phages compétiteurs. Ces prophages sont des éléments génétiques très mobiles, pouvant favoriser la propagation rapide de gènes de résistance parmi les bactéries, compliquant ainsi l'utilisation des phages thérapeutiques.

Notre équipe a identifié un prophage, chez le pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa, protégeant la bactérie contre une large gamme de phages thérapeutiques.

L'objectif du projet est d'identifier les mécanismes responsables de cette résistance à travers trois objectifs:
1) Identifier les gènes responsables en combinant des approches de mutagenèse et de gain de fonction.
2) Étudier les protéines impliquées via l'analyse des interactions protéine-protéine, de la modélisation 3D, et des mesures d'activité enzymatique.
3) Déterminer les éléments des phages thérapeutiques reconnus par le prophage. Des approches d'évolution expérimentale permettront d'identifier des mutants échappant à la résistance.

Ce travail permettra de mieux comprendre les mécanismes de résistance et d'améliorer les traitements phagiques en anticipant les obstacles posés par ces défenses naturelles.
Les infections bactériennes résistantes aux antibiotiques constituent une crise majeure de santé publique. La phagothérapie - l'utilisation de virus bactériens (phages)- s'impose comme une alternative prometteuse. Cependant, l'évolution de la résistance aux phages chez les bactéries risque de reproduire les défis posés par la résistance aux antibiotiques, compromettant potentiellement les résultats cliniques.
La résistance aux phages opère par deux grandes voies: extracellulaire via la modification des structures de surface permettant la fixation des phages à la cellule, et intracellulaire via l'activité de systèmes de défense spécialisés. Ces systèmes de défense peuvent fonctionner par divers mécanismes, soit agissant directement sur les éléments viraux (e.g., dégradation de l'ADN phagique), soit en induisant une mort cellulaire conduisant à une infection abortive. Récemment, il a été montré que les prophages - des phages intégrés dans les génomes bactériens - codent fréquemment des systèmes de défense dirigés contre des phages concurrents. Les prophages, acteurs reconnus du transfert horizontal de gènes, pourraient donc jouer un rôle central dans la dissémination rapide des gènes de défense au sein des populations bactériennes, et constituer un obstacle significatif à l'efficacité de la phagothérapie. Comprendre comment les prophages médient la résistance contre les phages thérapeutiques est donc crucial pour anticiper l'émergence de résistances dans les isolats cliniques.

Résultats préliminaires: Chez le pathogène ESKAPE Pseudomonas aeruginosa - une cible majeure de la phagothérapie - nous avons identifié un prophage, B3B1, qui confère une résistance à une large gamme de phages thérapeutiques. Nous avons découvert que B3B1 procure cette résistance via deux mécanismes : soit en inhibant l'attachement de certains phages thérapeutiques à la surface de la bactérie hôte, soit en bloquant le cycle intracellulaire d'autres phages thérapeutiques. Ces résultats suggèrent que le prophage B3B1 code plusieurs mécanismes de défense. Identifier les gènes et à caractériser les mécanismes moléculaires permettant la défense anti-phage médiée par le prophage B3B1 chez Pseudomonas aeruginosa.
Le projet est structuré en trois tâches et fait appel à des approches complémentaires alliant génétique, biochimie, bioinformatique et évolution expérimentale. Le projet est structuré en trois tâches combinant des approches de génétique, biochimie, bio-informatique et évolution expérimentale.
Comme système modèle, nous utilisons la souche de laboratoire de P. aeruginosa PAO1 curée de tous ses prophages et systèmes de défense résidents (souche viPAO1).

Tâche 1. Identifier les déterminants génétiques de la résistance médiée par le prophage

Le/La doctorant.e mettra en oeuvre deux approches complémentaires, minimisant ainsi les risques inhérents à chaque méthode :

i) la mutagenèse par transposition permettra d'identifier des mutants de B3B1 qui ne protègent plus leur hôte contre les phages thérapeutiques.

Le système de transposition mini-Tn5-gentamycine sera utilisé pour réaliser des insertions aléatoires dans le chromosome de la souche lysogène (i.e., portant le prophage B3B1). Afin de sélectionner uniquement les insertions dans le prophage B3B1, nous réaliserons une étape d'induction à partir de la banque de mutants, et utiliserons les particules virales pour lysogéniser notre souche de laboratoire viPAO1. Les bactéries lysogènes seront sélectionnées sur en présence de gentamycine pour sélectionner uniquement les bactéries lysogénisées par un prophage B3B1 portant une insertion mini-Tn5.

ii) une fragmentation méthodique du génome de B3B1, suivi de la construction d'une banque plasmidique permettra de déterminer l'unité génétique minimale nécessaire à la résistance.

Des fragments de 10kb de B3B1 (55kb) seront amplifiés par PCR et clonés dans le vecteur pHERD30T. Les différents plasmides obtenus seront transformés dans la souche viPAO1 et nous testerons quel plasmide confère la résistance aux phages thérapeutiques. Le fragment de 10kb portant la résistance sera ensuite fragmenté afin de déterminer précisément le(s) gène(s) impliqué(s) dans la résistance.

Une fois identifiés, les gènes permettront de construire des modèles HMM (Hidden Markov Model) pour cribler les bases de données de séquences publiques (RefSeq) et ainsi identifier la distribution et la prévalence du nouveau système de défense identifié.

Tâche 2. Identifier le mécanisme de défense médié par le prophage

i) Le/La doctorant.e identifiera les protéines bactériennes interagissant avec les protéines de défense identifiées via des approches protéomiques globales.

Nous mettrons en place un screen par double hybride bactérien. Les vecteurs nécessaires pour construire les fusions de nos protéines d'intérêt avec les fragments de l'adénylate cyclase sont déjà disponibles dans notre laboratoire. Nous chercherons à obtenir des librairies génomiques de la souche PAO1 construites précédemment (Houot et al., 2012, Microbiology PMID: 22628483).
Nous envisagerons également une approche de marquage de notre protéine d'intérêt (His-Tag) pour réaliser une approche de « pull-down » couplée à la spectrométrie de masse).
Les interactions entre les protéines bactériennes candidates identifiées et la protéines d'intérêt de B3B1 seront confirmées par des mesures d'interaction « deux à deux » (par exemple, via double hybride bactérien).

Si nous n'identifions aucune protéine interagissant avec notre protéine d'intérêt, nous testerons également sa capacité à lier l'ADN (e.g., EMSA, ChIP-Seq).

ii) Ces résultats, combinés à des prédictions fonctionnelles in silico (e.g., AlphaFold), guideront les expériences visant à identifier l'activité des protéines de défense.

Après purification, l'activité des protéines sera testée in vitro à l'aide d'essais biochimiques, tels que des essais enzymatiques (DNase, protéase, kinase, etc.). Si la protéine d'intérêt ne semble pas avoir d'activité enzymatique, nous mesurerons son activité de liaison avec les protéines bactériennes identifiées dans les screens précédents ou avec de petits ligands (par exemple, des nucléotides). Différentes approches pourront être mises en place (e.g., Thermophorèse, Calorimétrie de titration isotherme).

Le/La doctorant.e bénéficiera de l'expertise du laboratoire MMSB sur ces approches, ainsi que de l'assistance de la plateforme Protein Science Facility pour surmonter les difficultés éventuelles associées à ces approches.

Tâche 3. Identifier les protéines de phages thérapeutiques qui déclenchent les mécanismes de défense de B3B1

Dans la nature, les phages co-évoluent, et des mutations permettant de contourner les défenses codées par les prophages seront sélectionnées. La doctorante réalisera des expériences d'évolution pour isoler et séquencer des phages thérapeutiques mutants échappant aux systèmes de défense de B3B1.
Les mutations d'échappement identifiées indiqueront quels gènes/protéines des phages thérapeutiques sont ciblés par les systèmes de défense de B3B1.
Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes de défense opérés par B3B1 et montreront à quelle vitesse ces défenses peuvent être contournées par des phages virulents.

Formation de niveau Master en Microbiologie, avec réalisation d'un stage dans un laboratoire dans le domaine. De bonnes connaissances des techniques expérimentales de base employées en bactériologie (culture, clonage, dénombrement et suivi de population, etc.) sont essentielles.
Des connaissances des techniques expérimentales en biochimie seraient un avantage.
La connaissance de la biologie des bactériophages est un avantage.
Des capacités d'organisation sont essentielles.