Thèse Origine des Dérégulations des Cellules Souches Mésenchymateuses dans le Contexte des Métastases Médullaires du Neuroblastome H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Claude Bernard Lyon 1 École doctorale : CanBioS - Cancérologie, Biologie, Santé de Lyon Laboratoire de recherche : CRCL - CENTRE DE RECHERCHE EN CANCÉROLOGIE DE LYON Direction de la thèse : Veronique MAGUER-SATTA ORCID 000000021556068X Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-05-11T23:59:59 Le neuroblastome (NB) est un cancer pédiatrique souvent associé à des métastases médullaires aggravant le pronostic. Ces métastases sont généralement couplées à des perturbations hématopoïétiques, altérant la qualité de vie des patients. La moelle osseuse (MO) assure la régulation des cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment grâce aux cellules stromales mésenchymateuses (CSM). A partir de biopsies ostéomédullaires et de cellules isolées d'aspirats de MO de patients NB ou de donneurs sains, nos travaux actuels mettent en évidence un défaut de soutien aux CSH par les CSM nbBM associé à un remodelage de la matrice extracellulaire. En revanche, les mécanismes sous-jacents par lesquels les cellules de NB, de façon directe ou indirecte, modifient les propriétés de la matrice sécrétée par les CSM, restent inconnus. Ainsi le projet de recherche vise à comprendre comment les cellules de NB vont activer la voie de l'IFN et/ou le stress mécanique et ainsi altérer les propriétés matricielles via une dérégulation de la traduction. À terme, ce projet pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques limitant les perturbations de l'écosystème médullaire afin de freiner la progression du NB et de limiter des pathologies hématopoïétiques secondaires chez les patients. Le neuroblastome (NB) est l'un des cancers pédiatriques les plus fréquents. Dans un cas sur deux, des métastases sont déjà présentes au moment du diagnostic. Cellesci sont associées à un taux de survie inférieur à 50 % et sont le plus souvent localisées dans la moelle osseuse (MO). En conditions physiologiques, la MO régule la différenciation, l'autorenouvellement et le caractère « souche » des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Cette régulation est largement assurée par les cellules stromales mésenchymateuses (CSM)¹ via leur sécrétome, leurs interactions directes avec les CSH et leur capacité à se différencier en ostéoblastes et adipocytes.
Sur le plan clinique, l'invasion médullaire par le NB s'accompagne fréquemment de perturbations hématopoïétiques telles que des cytopénies². La sévérité de ces altérations est variable, mais elles constituent une charge supplémentaire qui affecte la qualité de vie des patients. De nombreuses études ont mis en évidence des altérations de la niche médullaire dans des contextes leucémiques, avec une différenciation des CSM biaisée vers des lignages ostéoblastique ou adipocytaire³,, une fibrose médullaire marquée par des dépôts significatifs de réticuline, ou encore une augmentation de la pression intramédullaire. Néanmoins, aucune étude n'a, à ce jour, exploré l'impact des niches médullaires envahies par le NB sur la régulation de l'hématopoïèse.
Pour comprendre le rôle des CSM envahies au sein de la moelle dans les anomalies hématopoïétiques observées chez les patients NB, nous avons collaboré avec des cliniciens afin de caractériser des aspirats médullaires d'enfants atteints de NB (nbBM) et de donneurs sains appariés sur l'âge (hBM) (Fig. 1A). Nos travaux actuels indiquent que les CSMnbBM présentent une sécrétion de matrice extracellulaire (MEC) altérée et sont associées à un soutien déficient des CSH. Le sécrétome des CSM étant un régulateur majeur des CSH, il pourrait contribuer aux altérations observées dans la moelle associée au NB. L'analyse par spectrométrie de masse des milieux conditionnés de cultures CSMnbBM et CSMhBM a révélé un enrichissement en ontologies liées à la MEC chez les CSMnbBM (Fig. 1B). Nous avons donc examiné les propriétés physiques et moléculaires de ces MEC, connues pour réguler les CSH,, et montré que les matrices produites par les CSMnbBM contiennent moins de collagènes I/III (Fig. 1C), présentent une organisation fibrillaire plus orientée, et sont significativement moins rigides (Fig. 1D) que les MEC dérivées des CSMhBM. Ces résultats témoignent d'une réorganisation du collagène par les CSMnbBM.
En outre, les MEC produites par les CSMnbBM ne parviennent pas à maintenir le potentiel clonogénique des cellules hématopoïétiques immatures, un défaut associé à une adhésion à la MEC altérée par la perte d'ancrage médiée par FAK (Fig. 1E). Enfin, compte tenu de la complexité de l'environnement médullaire, nous avons également utilisé un modèle in vitro de moelle osseuse 3D (3DBOM), reproduisant l'hétérogénéité moléculaire et fonctionnelle de l'écosystème, et montré que les modèles 3DBOM dérivés de CSMnbBM entraînent une diminution significative de la population de CSH (Fig. 1F).

Nos travaux montrent que les perturbations de l'hématopoïèse associées au NB métastatique sont dues, au moins en partie, à une altération de la niche médullaire médiée par des CSM sécrétant une matrice extracellulaire (MEC) remodelée (Bounaud et al., en préparation). Toutefois, les mécanismes par lesquels les CSMnbBM sont réorganisées et modifient ainsi la MEC restent à élucider.
L'analyse protéomique de CSM primaires a révélé un enrichissement de la voie de l'IFN (IFIT1, IFIT3, ISG15...) dans les CSMnbBM comparées aux CSMhBM (Fig. 2A). De plus, lors de cocultures entre CSMhBM et cellules NBCherry, nous avons observé un transfert de matériel des cellules NB vers les CSM, visible par la présence de points Cherry+ à l'intérieur des CSM (Fig. 2B). Cette observation a été confirmée par cytométrie en flux, montrant l'apparition de CSM Cherry+ après deux jours de coculture. De manière intéressante, l'analyse protéomique des CSMnbBM a également mis en évidence un enrichissement de la voie cGASSTING (Fig. 2C), un capteur de l'ADN cytosolique (comme l'ADN mitochondrial) connu pour réguler les voies inflammatoires, métaboliques et la traduction. Des cocultures préliminaires confirment d'ailleurs une augmentation de la phosphorylation de STING dans les CSM en présence de cellules NB (Fig. 2D). L'ensemble de ces données suggère que les contacts directs ou indirects entre CSM médullaires et cellules NB activent la voie de l'IFN, un mécanisme susceptible de contribuer au remodelage de la MEC.
À l'inverse, l'analyse transcriptomique des principales protéines dérégulées - notamment IFIT1, IFIT3 ou Col1A1 - n'a révélé aucune différence d'expression des ARNm entre CSMnbBM et CSMhBM (Fig. 3A), indiquant un biais translationnel dans les CSMnbBM. De façon cohérente, une GSEA a confirmé une diminution de la biogénèse ribosomique dans les CSMnbBM (Fig. 3B), suggérant l'existence d'un programme translationnel spécifique induit par les cellules NB. Les ribosomes pouvant varier dans leur composition, certaines formes spécialisées traduisent préférentiellement des sousensembles spécifiques d'ARNm. En particulier, la 2Ométhylation (2Ome) des ARNr contribue à cette hétérogénéité ribosomique, et des altérations de 2Ome dans les cancers favorisent la traduction d'ARNm déterminés. Cette modification est catalysée par la fibrillarine (FBL) et guidée par des snoRNAs de type C/D (SNORD)¹,¹¹.
Le profilage des 2Ome des ARNr par la technologie innovante RiboMethSeq a identifié des altérations spécifiques dans les CSMnbBM, notamment une diminution de la 2Ome aux sites 28S\_Gm4588 et 28S\_Um2402 (Fig. 3C), ainsi qu'une augmentation concomitante de l'expression des snoRNAs associés, SNORD21 et SNORD126 (Fig. 3D). Ces résultats suggèrent que la composition ribosomique est elle aussi modifiée dans les CSMnbBM, ce qui pourrait influer sur leur capacité à sécréter la MEC.
Soutenant l'hypothèse d'une influence directe des NB sur les CSM, nos observations préliminaires de biopsies médullaires chez des patients NB au diagnostic montrent que les cellules NB peuvent occuper jusqu'à 80 % de la moelle dans certaines zones (Fig. 4A). Étant donné que la MO est un espace confiné ne pouvant se dilater, une telle infiltration suggère une augmentation du stress mécanique au sein de la niche. Pour reproduire ces forces compressives, notre laboratoire a développé un système de confinement cellulaire¹² (Fig. 4B) permettant d'étudier les effets d'une déformation prolongée sur la biologie des cellules. L'application de ce système aux CSMhBM a entraîné des modifications de la sécrétion des molécules BMP (Fig. 4C) et pourrait également affecter d'autres mécanismes moléculaires.
Dans l'ensemble, ces résultats nous amènent à formuler l'hypothèse que la reprogrammation des CSMnbBM pourrait être induite par l'activation de la voie de l'IFN et/ou par une augmentation du stress mécanique dans la MO, deux mécanismes susceptibles de moduler les programmes translationnels.

Experience en culture de cellules primaires, approches expérimentales biomécaniques et analyses spatiales